利用荧光定量PCR检测PCV2的方法建立及应用

【摘要】猪圆环病毒2型(porcinecircovirus2,PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎与肾病综合征、母猪繁殖障碍、仔猪先天性震颤和猪呼吸道综合征等疾病的主要病原，是目前威胁世界养猪业的重要病原之一。本研究建立了检测PCV2DNA的SYBRGreen实时荧光定量PCR方法和检测PCV2mRNA的TqaMan荧光定量PCR检测方法，旨在为PCV2感染后病毒载量的动态检测、临床发病猪和亚临床感染猪的鉴别、病毒组织亲嗜性及防治效果评价等方面的研究奠定基础。主要内容及结果如下：1PVC2ORF2基因的克隆根据GenBank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计一对特异引物，通过PCR扩增得到目的基因片段，之后通过连接、转化、阳性克隆筛选与鉴定、核苷酸序列测定等一系列方法，成功将目的基因克隆到载体上，获得重组质粒。2PVC2SYBRGreen荧光定量PCR检测方法的建立通过对GenBank上发表的PCV1和PCV2ORF2的基因序列进行分析，选择PCV2Cap基因的保守区域，设计并合成了一对特异性的引物，通过对荧光定量PCR反应条件的优化，以定量的10倍系列稀释的重组质粒p-18T-Cap为阳性标准品绘制标准曲线建立了PCV2SYBRGreen荧光定量PCR检测方法。试验结果表明，该方法检测过程耗时短，特异性强，其敏感性比普通PCR检测方法高1000倍，最低可检测到10拷贝DNA/μL；其标准曲线线性范围是1×102～1×107拷贝，且具有良好的重复性。3PVC2mRNATqaMan荧光定量PCR检测方法的建立选择PCV2Cap基因的保守区域，设计了一对引物和与之匹配的探针。以重组质粒p-32T-Cap为模板，通过PCR合成DNA片段，反转录复制成mRNA作为阳性标准品。通过优化反应条件和参数，建立了检测PVC2mRNA的TqaMan荧光定量PCR方法。该方法特异性好，敏感性高，最低可检测到10RNA拷贝/μL，标准曲线的线性范围是100～109拷贝/μL，且具有良好的重复性。4应用建立的方法对PCV2体外感染的PK-15细胞及其上清液中DNA和mRNA表达量以及从养猪场采集的不同组织样本中PCV2进行检测，结果表明PK-15细胞内PCV2DNA和mRNA最早于感染后24小时检测到，在感染后48～96小时两者均呈明显呈增长趋势。细胞上清液中PCV2DNA载量的变化规律和PK-15细胞中基本相同；但其mRNA的拷贝数在感染后48～96小时几乎无增长。对临床样本的检测结果显示，PCV2在不同的组织中广泛分布，然而，该病毒在同一组织中的mRNA载量与DNA含量并不一定呈正相关。
【作者】郭慧娟；
【导师】张国伟；
【作者基本信息】天津农学院，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】猪2型圆环病毒；SYBRGreen荧光定量PCR；TaqMan荧光定量；RT-PCR；mRNA；

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